细胞骨架是一种网状的纤维结构，它高度动态，并在不同阶段展现出不同的形态。它主要由微丝、微管和中间丝组成。微丝主要由肌动蛋白组成，肌动蛋白以两种形式存在：球状肌动蛋白（G-actin）和纤维状肌动蛋白（F-actin）。微丝的组装涉及G-actin向F-actin的转变。

图1. 细胞骨架结构（包括微丝、微管和中间丝）。图片来源：“医学细胞生物学：第7章 细胞骨架与细胞运动”。

鬼笔环肽是一种环状七肽，是最早发现的环肽之一，从毒鹅膏（Amanita phalloides）中分离出来。它通过与纤维状肌动蛋白（F-actin）结合并稳定其结构，有效地阻止肌动蛋白丝的解聚。由于鬼笔环肽对F-actin具有紧密且选择性的结合能力，它可以揭示细胞内微丝骨架的分布，因此使用鬼笔环肽进行荧光标记在生物显微镜技术中得到了广泛应用。
 

图2. 鬼笔环肽的结构

值得注意的是，未修饰的鬼笔环肽不能穿透细胞膜，这使得它在涉及活细胞的实验中难以直接应用。用FITC（荧光素异硫氰酸酯）和罗丹明等荧光物质标记的鬼笔环肽可以特异性地结合到真核细胞中的F-actin上，从而揭示细胞内微丝骨架的分布。

Arcegen Biosciences提供多种鬼笔环肽产品，主要根据不同的荧光标签来区分，这些不同的荧光标签在激发时会产生不同的荧光颜色。这种多样性满足了不同机器对激发和发射波长的不同要求，允许在与其他荧光染料共染色时区分不同的荧光颜色。

实验程序

鬼笔环肽的制备

将0.1毫克的鬼笔环肽溶解在1毫升的无水甲醇（或DMSO或无水乙醇）中，以制备母液。母液可以在黑暗中长期存放在-20°C的环境中。工作浓度为5微克/毫升，可以通过将母液用PBS稀释20倍来实现。使用前进行稀释。

染色程序

1. 使用PBS缓冲液冲洗细胞两次，每次10分钟；
2. 使用3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛固定细胞20分钟，然后用PBS缓冲液冲洗细胞两次；
3. 在室温下使用5微克/毫升的FITC标记鬼笔环肽染色细胞30-60分钟（夏季时间可能更短），然后用PBS缓冲液冲洗细胞两次；
4. 使用DAPI或Hoechst 33258染色细胞核10分钟，然后用PBS缓冲液冲洗细胞两次；
5. 去除多余的水分，添加荧光封片液（中性或微碱性缓冲液与等量的甘油混合），盖上盖玻片，然后在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。
 

客户案例

客户来源：四川大学华西口腔医院牙科诊所

细胞类型：骨髓间充质干细胞

比例尺：100微米

参考文献：Zhu Z, Jiang S, Liu Y, 等。微米或纳米：不同粒径镁金属有机框架-74的生物安全性和生物效能评估。纳米研究，2020, 13(2): 511-526。

产品介绍：使用的染色产品是FITC标记的鬼笔环肽，它使细胞呈现绿色荧光。图像显示了使用MTT实验、FITC标记的鬼笔环肽染色和DAPI染色来确定Mg-MOF74对骨髓间充质干细胞的安全剂量，确保后续实验在安全剂量范围内进行。

细胞类型：骨髓间充质干细胞

比例尺：50微米

参考文献：Fan Z, Xiao L, Lu G, Ding Z, Lu Q. 水溶液中不溶性无定形丝素蛋白支架。J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2020;108(3):798-808. doi:10.1002/jbm.b.34434

产品介绍：使用的染色产品是罗丹明标记的鬼笔环肽，它使细胞呈现红色荧光。图像显示了罗丹明标记的鬼笔环肽染色和DAPI核染色，观察骨髓间充质干细胞在不同再生丝素蛋白支架上分化为内皮细胞的情况，使用共聚焦显微镜观察。

总结：荧光和生物素标记的鬼笔环肽衍生物比肌动蛋白抗体具有显著优势。鬼笔环肽缀合物的结合在不同物种（包括动物和植物）的肌动蛋白变化中保持不变。此外，它们的非特异性染色可以忽略不计。因此，染色和未染色区域之间的对比度很高。
 

注意事项

鬼笔环肽分子量小，可以轻易穿透细胞，因此不需要对细胞进行冷丙酮或TRITON X-100处理。它具有高度毒性，因此在操作时请戴上手套。

产品特点

高亲和力：Kd= 20 nM；

强特异性：选择性地结合到纤维状肌动蛋白（F-actin），而不结合单体肌动蛋白（G-actin）；

优于抗体染色：鬼笔环肽没有物种限制，几乎无非特异性染色，使得染色和未染色区域之间的对比度极高；

高灵敏度：染色浓度在纳摩尔级别（nM）即可满足实验要求；

与肌动蛋白活性良好兼容：鬼笔环肽衍生物是小分子，直径约为12-15Å，分子量小于2000 Da，允许标记的肌动蛋白保持许多生理特性；

广泛的适用性：没有物种差异；同样适用于甲醛固定和通透化的组织样本。
 

常见问题解答

Q1: 可以在活细胞中进行鬼笔环肽染色吗？
A：鬼笔环肽染色需要对样本进行固定和通透化处理，以促进鬼笔环肽与F-actin之间的结合，从而获得更好的染色效果。

Q2：我的细胞样本转染了含有GFP的质粒，我应该选择哪种鬼笔环肽？
A：你可以选择用TRITC（橙色）、iFluorTM 555（橙色）或iFluorTM 647（远红）标记的鬼笔环肽。

Q3：对于贴壁细胞，每个样本需要多少工作液？
A：贴壁细胞染色只需要足够的工作液来完全覆盖细胞。

Q4：不同类型的鬼笔环肽有什么区别，我该如何选择？
A：区别在于荧光标签，会产生不同的荧光颜色。这有助于区分其他共染色荧光染料的荧光颜色。在选择时，确保机器满足激发和发射波长的要求。

Q5：鬼笔环肽染色有物种特异性吗？
A：在染色活体动物细胞时没有物种特异性。

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